Lange hegten die Salzburger Landesfürsten den Wunsch, eine eigene Universität zu gründen. 1618 konnte unter Erzbischof Markus Sittikus von Hohenhems dann endlich der Grundstein für die Errichtung eines Gymnasiums im Bereich des Frauen- oder Frohngartens gelegt werden (Bereich von heutigem Universitätsgelände, -platz und -kirche). Die Betreuung dieser Einrichtung übernahmen die Benediktiner der Abtei St. Peter. Neben dem äußerlich schlicht wirkenden Gebäude wurde bereits damals die dem heiligen Borromäus geweihte Kapelle des „Saecellums“ errichtet.

Abt Albert III. Keuslin wurde im Juli 1622 zum Rector Magnificus ernannt. Im Oktober darauf erhob Kaiser Ferdinand II. das benediktinische Gymnasium zur Universität, die am 8. Oktober 1622 durch ihren Gründer Erzbischof Paris Graf von Lodron feierlich eröffnet wurde.

Aufbau und Erhalt der Universität übernahmen 33 Benediktinerklöster aus Salzburg, der Schweiz und dem süddeutschen Raum  sowie den Habsburgischen Ländern. In relativ kurzer Zeit wurde erreicht, dass Vorlesungen in allen vier Fakultäten abgehalten werden konnten.

Unter der Leitung von Dombaumeister Santino Solari wurde 1627 ein erster Ausbau vorgenommen. Der Mittelflügel mit der Großen Aula wurde 1631 fertig gestellt und 1778 von Wolfgang Hagenauer umgestaltet. 1655 wurde der Südflügel mit dem Anbau der Kreuzkapelle vollendet. Der Hof ist mit Arkadengängen und Kreuzgratgewölben ausgestattet, wobei die Obergeschoßarkaden im Südtrakt erst 1981 freigelegt wurden.

Die von Santino Solari errichtete „Aula Academica“ wurde ursprünglich als Kongregationssaal für die Marianische Kongregation des Kollegiums verwendet. Die Einweihung fand unter Paris Lodron im Jahre 1654 statt.

Vorerst hatte der Saal glatte, weiße Wandflächen und eine hölzerne Kassettendecke. In den Achsen von Ost- und Westseite befinden sich sieben bzw. acht leicht segmentbogige Fenster im unteren und Ochsenaugenfenster im oberen Teil mit in gleicher Achse befindlichen Darstellungen der 15 Geheimnisse des Rosenkranzes. Im ehemaligen Altarblatt von Adrian Bloemart wird Christus als Weltenrichter dargestellt, umgeben von Maria und diversen Heiligen. (Die Aula wurde bis zur Einweihung der Universitätskirche auch für die Abhaltung von Messen verwendet.) Vor der Anbringung der Gemälde wurde die Gliederung der Fensterachsen durch illusionistisch gemalte Fenster an den Schmalseiten fortgeführt.

Das Marmorportal im Westteil der Nordwand wurde im Jahre 1700 wahrscheinlich von Johann Bernhard Fischer von Erlach eingefügt. 1780/81 zog man dann noch die Weißdecke mit klassizistischem Stuck ein.

Unter den vielseitigen Verwendungszwecken finden wir damals wie heute die Aufführung von Konzerten und Theaterstücken. So wird für das Jahr 1742 die Aufführung von Leopold Mozarts „Antiquitas personata“ genannt. Dessen Sohn Wolfgang Amadeus trat 1761 als Fünfjähriger im Schuldrama „Sigismundus Hungariae Rex“ als tanzender Page auf. Und am 13. Mai 1967 wurde hier seine Oper „Apollo et Hyacinthos“ uraufgeführt, wobei er selbst das Clavicembalo spielte.

1663 wurde mit dem Südtrakt das „Saecellum“ als Hauskapelle erweitert. Die Deckenbilder des Saalbaus mit seinem fünfjochigen Kreuzgratgewölbe zeigen in ovalen Rahmen wiederum die 15 Geheimnisse des Rosenkranzes. Der von Wolfgang Hagenauer entworfene Hochaltar wurde 1768 fertig gestellt. Um 1730 ist die Einrichtung mit zwei Seitenaltären ergänzt worden. Bleireliefs zeigen Szenen aus dem Leben der Heiligen Benediktus und Borromäus. Diese wurden Johann Baptist Hagenauer geschaffen. Zur Einrichtung gehören noch eine Seitenkapelle und eine Sakristei.

Kurz vor Ende der geistlichen Herrschaft im Jahre 1800 widmete Erzbischof Hieronymus Graf Colloredo der Universität noch 100.000 Gulden Reichswährung. So sollte die Medizinische Fakultät und die Bergakademie finanziert werden. 1803 sollte eine Kommission unter anderem einen Lehrstuhl für Bergbau einrichten. Dieses Vorhaben scheiterte aus politischen Gründen.

Schließlich wurde von Kurfürst Ferdinand III. von Toskana in den zwei Jahren seiner Herrschaft (1803-05) eine eigene Medizinische Fakultät gegründet.

Nach der Angliederung Salzburgs an Bayern im Jahre 1810 wurde die Universität aufgelöst. An ihre Stelle trat ein Lyzeum, also eine Bayerische Hochschule mit theologischen und philosophischen Inhalten. Eine medizinische Lehranstalt wurde ebenfalls errichtet. Der theologische Teil des Lyzeums wurde dann 1850 wieder zur Universitätsfakultät erhoben.

An der Südfassade des alten Universitätsgebäudes wird die Gliederung der alten Universität mit dem Sonnenuhrfresko von Georg Jung dargestellt. Die Madonna aus dem Gnadenbild von Maria Plain schwebt als Schutzpatronin Salzburgs über den drei Fakultäten Theologie, Philosophie und Jurisprudenz. Jung war Mitglied des „Sonderbundes österreichischer Künstler“, der 1925 von Anton Faistauer gegründet wurde und im selben Jahr in der Großen Aula eine erste große Ausstellung mit einem Querschnitt der Kunstlandschaft in Deutschland und Österreich zeigte.

Erst 1962 konnte die Universität wieder errichtet werden. Heute verteilt sich die Universität über eine Vielzahl von Standorten in der Stadt Salzburg, wobei sich im ursprünglichen Universitätsgebäude noch die theologische Fakultät befindet. Rektorat und Administration sind in den Kapitelhäusern (Kapitelgasse) untergebracht.